Содержание глутаминовой кислоты в камерной влаге у больных первичной открытоугольной глаукомой

Результаты исследований последних лет существенно повлияло на представления о патогенезе глаукоматозной атрофии зрительного нерва – глаукоматозной оптической нейропатии.

Было установлено, что характерным проявлением глаукоматозной оптической нейропатии является апоптоз – гибель ганглиозных клеток сетчатки. Quigley считает, что поврежденный, возможно, вследствие высокого ВГД, аксон ганглиозной клетки сетчатки не несет достаточной информации, что приводит к активации механизмов естественной гибели клетки. Возможно, эти процессы активизируются недостаточностью кровотока в сосудах глаза при повышенном ВГД. Было показано, что одновременно с этим имеется значительное увеличе­ние содержания глутаминовой кислоты (глутамата) в стекловидном теле больных первичной открытоугольной глаукомой (ПОУГ). Глутамат является основным нейромедиатором  ЦНС и сетчатки. В то же время повышение концентрации глутамата выше физиологического уровня вызывает в сетчатке блокаду межнейрональной передачи нервных импульсов и сочетается с селективным апоптозом ганглиозных клеток сетчатки из-за нейротоксического действия глутамата. Brooks D.E.  обна­ружили в собачьих глазах с экспериментально вызванной глаукомой повышенное содержание витреального глута­мата, триптофана и низкое содержание глицина по срав­нению с контролем. По мнению авторов, высокая концен­трация глутамата токсична для ганглиев сетчатки и дока­зывает ишемический механизм нарушений, происходя­щих и клетках сетчатки.

Сама по себе идея о нейротоксическом действии глута­мата на нервную ткань, к частности, на ганглиозные клет­ки сетчатки, заимствована из неврологической практики. Неврологи около 20 лет придают значение большим кон­центрациям данного трансмиттера в развитии такой пато­логии, как болезнь Альцгеймера, рассеянный склероз, деменция, амиотрофический боковой склероз и другие. Повышенное содержание глутамата в стекловидном теле больных глаукомой, гибель ганглиозных клеток сетчатки под его воздействием в опытах на крысах позволили Е.В. Dreyer и соавтору,  предположить, что данный механизм их гибели имеет место и при ПОУГ. Однако причина внутри­клеточного выпуска глутамата не полностью ясна. Е.В. Dreyer и соавтор  считают, что, возможно, высокое внут­риглазное давление приводит к выходу глутамата во внут­риклеточные пространства, вызывая гибель клеток, кото­рый токсичен для ганглиозных клеток. Второй вероятной причиной гибели клеток, но мнению авторов, является сбой в ферментных системах, ответственных за разруше­ние данного нейромедиатора после выхода его из синап­сов. Трудность подтверждения этих воззрений заключает­ся в том, что очень трудно проверить данные факты па «живом» глазу, однако несомненно, что большие концептрации гутамата токсичны для нервной ткани.

Учитывая вышесказанное, целью нашего исследования явилось обнаружение глутамата у больных ПОУГ.

Материалы и методы исследования

Опытную группу составили 10 больных ПОУГ (6 муж­чин, 4 женщины, средний возраст — 74 года), у которых за­биралась камерная влага во время экстракапсулярной экс­тракции катаракты с антиглаукоматозным компонентом. 8 больных были с развитой стадией ПОУГ, 2 с далекозашедшей. Контрольную группу составили больные со стар­ческой катарактой — 14 пациентов (11 мужчин, 3 женщи­ны, средний возраст — 68 лет). Основная и контрольная группы были сопоставимы по возрасту и сопутствующим соматическим заболеваниям.

В основу метода положены описанные Боде и Гири методы количественного определения аминокислот в ви­де медных производных с нингидридином после хроматографического их разделения на бумаге в нашей моди­фикации.

1. Подготовка пробы для анализа. Пробы камерной жидкости объемом 0,1−0,2 мл взвешивают на аналитических весах, упаривают досуха на водяной бане при 40°С в стек­лянных микрочашках, используя плавающий штатив. Сухой остаток растворяют в 0,05 мл дистиллированной воды.

2. Получение одномерных хроматограмм камерной жидкости глаза. 20 мкл полученных растворов порциями по 5 мкл с помощью автоматической пипетки наносят на хроматографическую бумагу марки «быстрая» размером 2*27 см. Хроматографирование проводят нисходящим мето­дом два раза в одном направлении сначала в смеси раство­рителей I, затем два раза в смеси II. Смесь I: н-бутиловый спирт, ледяная уксусная кислота, дистиллированная вода (4:1: 5). Смесь II: н-бутиловый спирт, ледяная уксусная кислота, дистиллированная вода (40 : 15:5). После каждо­го пропускания растворителя бумагу высушивают па воз­духе и снова помещают в хроматографическую камеру. Вре­мя прохождения растворителя в одном направлении 7 ча­сов. Высушенную хроматограмму погружают на несколько секунд в 0,5% раствор нингидрина в ацетоне, просушивают в течение нескольких минут на воздухе и подогревают 10 минут к сушильном шкафу при 50°С для развития окраски. Пятна аминокислот становятся более четкими через сутки, поэтому определение количественного содержания амино­кислот следует проводить на следующий день.

3. Количественное определение глутаминовой кис­лоты в камерной жидкости глаза. Фиолетовые пятна, соответствующие глутаминовой кислоте, вырезают, разре­зают на мелкие кусочки и помещают в микропробирки, со­держащие 0,25 мл спиртового раствора сульфата меди. Фи­олетовая окраска переходит в оранжево-красную в резуль­тате образования медного производного аминокислот с нингидрином. Экстракцию продолжают в течение одного часа при комнатной температуре. Интенсивность окраски измеряют на фотоэлектроколориметре Humalyzer 2000 при длине волны 505 нм в микрокюветах против контрольной пробы на бумагу. Расчеты по содержанию аминокислоты проводят по калибровочному графику, полученному со стандартными растворами глутаминовой кислоты.

4. Построение калибровочного графика. Готовят рас­творы глутаминовой кислоты 0,001 М, 0,00075 М, 0,0005 М, 0,000375 М, 0,00025 М. На бумагу наносят по 20 мкл растворов. Расчет производят по формуле: А=С*5*10⁻²/V, А — концентрация глутамитговой кислоты в камерной влаге (мкг/мл); С — содержание глутаминовой кислоты, найденной по калибровочному графику (мкг/мл); V -объем проб (мл).

Результаты исследования и обсуждение

Содержание глутамата камерной влаги в контрольной группе составило 28,6+1,6 мкг/мл, при ПОУГ — 84,9±28,7 мкг/мл (разница статистически недостоверна, р>0,05).

Хотя нам и  не получено статистически достоверных различий в содержании глутамата у больных ПОУГ и воз­растной катарактой, однако имеется явная тенденция к бо­лее высокой концентрации данного нейромедиатора в ка­мерной влаге больных ПОУГ. У 5 из 10 больных ПОУГ содержание глутамата в камерной влаге было значительно выше, чем в контрольной группе и колебалось в пределах от 37,6 мкг/мл до 260,3 мкг/мл.

У больных старческой катарактой наивысшая концен­трация глутаминовой кислоты составила всего 33 мкг/мл.