Сегодня 23 апреля 2024
Медикус в соцсетях
 
Задать вопрос

ЗАДАТЬ ВОПРОС РЕДАКТОРУ РАЗДЕЛА (ответ в течение нескольких дней)

Представьтесь:
E-mail:
Не публикуется
служит для обратной связи
Антиспам - не удалять!
Ваш вопрос:
Получать ответы и новости раздела
13 июля 2002 00:00   |   Докт. биол. наук проф. Дмитриев Г.А., докт. биол. наук, проф. Киселев В.И., канд. биол. наук Орлова О.Е. (клинико-лабораторный центр «Пастер»), канд. биол. наук Сидорович С.Ю., канд. биол. наук Брагина Е.Е., канд. биол. наук Коликова Т.Г, канд. биол. наук Вахнина Т.Е., докт. мед. наук Кисина В.И., Латыпова М.Ф.

ЛАБОРАТОРНАЯ ДИАГНОСТИКА УРОГЕНИТАЛЬНОГО ХЛАМИДИОЗА. ПОСОБИЕ ДЛЯ ВРАЧЕЙ

Краткая аннотация.
Пособие предназначено для сотрудников дерматовенерологической лабораторной службы. Пособие для врачей посвящено методам диагностики урогенитального хламидиоза. Представлены краткие сведения об особенностях строения и жизненного цикла Chlamydia trachomatis, даны характеристики бактериологического, бактериоскопического, иммунологического и молекулярно-биологического методов диагностики урогенитального хламидиоза, проанализированы критерии оценки препаратов для постановки диагноза, область применения, достоинства и недостатки методов. Дана методика сбора материала, подготовки препаратов и окраски.
ВВЕДЕНИЕ
Хламидиозы — разнообразные по патогенезу и клиническим проявлениям заболевания людей и животных.
В последние десятилетия в патологии человека неуклонно возрастает роль антропонозных хламидиозов. Особенно большое значение приобретают урогенитальные хламидийные инфекции, которые относятся к числу наиболее распространенных заболеваний, передаваемых половым путем. Они поражают мужчин и женщин, все чаще регистрируются у новорожденных, оказывают негативное влияние на репродуктивное здоровье и часто являются причиной бесплодия.
Проблема хламидиозов имеет не только медицинское, но и социально-экономическое значение. Успешная организация борьбы с этими заболеваниями возможна лишь при условии их своевременного и полного выявления, а это, учитывая отсутствие патогномонической симптоматики, представляет значительные трудности. В этой связи решающее значение в постановке диагноза приобретают методы лабораторной диагностики.
В настоящих методических рекомендациях представлены основные методы лабораторной диагностики урогенитального хламидиоза с учетом возможностей практической лабораторной службы.
1. КРАТКАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА ХЛАМИДИИ
Хламидии — грамотрицательные бактерии с облигатным внутриклеточным паразитизмом, характеризующиеся широким спектром естественных хозяев. Биологическое своеобразие хламидий, выражаемое в энергозависимом паразитизме и уникальном цикле развития, определяет самостоятельное положение этих микроорганизмов в системе прокариотов.
Хламидии выделены в отдельный порядок Chlamydiales, включающий одно семейство Chlamydiaceae, содержащее один род Chlamydia, состоящий из 4 видов: С/7. trachomatis, Ch. psittaci, Ch. pneumoniae, Ch. pecorum.
Вид Ch. trachomatis объединяет микроорганизмы, вызывающие заболевания, главным образом у человека (антропонозные хламидиозы). Патогенные для человека Ch.trachomatis разделены на 3 биовара — возбудители венерической лимфогранулемы, возбудители гиперэндемической трахомы, возбудители спорадических заболеваний глаз (паратрахома, конъюнктивит с включениями у новорожденных и взрослых) и урогенитального хламидиоза (НГУ, цервициты, сальпингиты, проктиты, простатиты, эпидидимиты, пневмонии новорожденных)
Хламидии — облигатные внутриклеточные паразиты, отличающиеся от других микроорганизмов уникальным жизненным циклом, который включает в себя последовательную смену двух высокоспециализированных форм, адаптированных для внутри- и внеклеточного существования. Внеклеточные формы — инфекционные метаболически неактивные элементарные тельца (ЭТ) диаметром 0,2 — 0,3 мкм, окружены ригидной малопроницаемой клеточной стенкой, содержат плотный нуклеоид и обезвоженный протопласт, что обеспечивает резистентность к факторам внешней среды при переносе от клетки к клетке и от хозяина к хозяину. ЭТ устойчивы к действию антимикробных препаратов. Клеточная стенка ЭТ имеет характерное для грам-негативных бактерий строение. Ригидность клеточной стенки обусловлена наличием множественных дисульфидных поперечных связей между богатыми цистеином белками. Эти белки важны для обеспечения стабильности и непроницаемости ЭТ.
Хламидии имеют сложную антигенную структуру. Выделяются три основных антигенных комплекса: родоспецифический, видоспецифический и сероварспецифический. Как и у других грам-негативных бактерий, в клеточной стенке хламидий содержатся термостабильные липополисахариды (ЛПС), представляющие собой один из основных родоспецифических антигенов микроорганизма. Антигенный эпитоп, определяющий родоспецифичность, расположен в углеводном участке и представлен олигосахаридом из 3 мономеров.
Видоспецифические антигены определяют принадлежность штаммов хламидий к соответствующему виду, типоспецифические антигены позволяют дифференцировать различные серовары (серотипы) хламидий внутри вида. Антигенные детерминанты видо- и типоспецифических антигенов локализованы в различных участках (доменах) богатого цистеином основного белка наружной мембраны (ОБНМ) и достаточно хорошо изучены для Ch.trachomatis
ЭТ прикрепляются к чувствительным клеткам — мишеням и поглощаются ими с формированием внутриклеточной вакуоли. Они реорганизуются в метаболически активные неинфекционные внутриклеточные формы — ретикулярные тельца (РТ), проходя стадию промежуточных телец (ПТ) через 6−8 час после инфицирования клетки-хозяина in vitro. Ретикулярные тельца — вегетативная неинфекционная форма, пластичные сферические клетки с диффузной укладкой ДНК нуклеоида и обводненным протопластом, содержащим рибосомы. Диаметр РТ 0.6−1.5 мкм. РТ делятся бинарным образом внутри образующейся эндосомы, которая представляет собой микроколонию и выявляется при микроскопировании как хламидийное включение. РТ используют субстраты клетки — хозяина для синтеза РНК, белка, протеинов, но не способны синтезировать энергетические субстраты — АТФ, ГТФ, являясь «энергетическими паразитами». РТ чувствительны к действию антибиотиков. Во включениях, образованных Ch.trachomatis, через 30−60 час после инфицирования накапливается гликоген, достигая уровня, визуализирующего включение при окраске йодом, что является критерием при диффенциальной диагностике Ch.trachomatis и Ch. psittaci После периода роста и деления РТ подвергаются обратной трансформации через стадию ПТ в ЭТ. Цикл развития считается завершенным после выхода из клетки инфекционных ЭТ, что позволяет им вступать в новый жизненный цикл, распространяя инфекцию в еще не инфицированных клетках. Полный цикл развития хламидий при изучении in vitro на культуре чувствительных клеток длится 48−72 час, в зависимости от штамма хламидий, природы клеток-хозяев и условий среды. Цитоплазматические включения, содержащие хламидий, выявляются при световой, люминесцентной и фазово-контрастной микроскопии.
В последнее время появляется все больше данных о возможности существования латентных или персистирующих форм хламидий как при моделировании in vitro, так и в организме больного in vivo. Эти формы могут не отличаться по клинической картине вызываемых заболеваний, но биологически представляют собой результат нарушения жизненного цикла хламидий на различных фазах. Латентные формы хламидий наблюдаются при ингибировании жизненного цикла на стадии ЭТ в тех случаях, когда нет возможности вступления в новый цикл развития (например, сохранение ЭТ при отсутствии чувствительных клеток- мишеней). Ингибирование перехода внутриклеточных РТ в ЭТ приводит к персистированию атипичных включений с делящимися РТ хламидий. При моделировании персистенции in vitro показано, что персистирование хламидий может быть инициировано рядом факторов, таких, как действие антибиотиков, недостаток ингредиентов питательной среды, действие цитокинов, например, интерферона. При этом отмечается изменение чувствительности хламидий к антибиотикам. Существование персистирующих форм затрудняет диагностику урогенитального хламидиоза и требует комплексного применение методов лабораторной диагностики с учетом давности заболевания и наличия симптоматики.
2. Методы лабораторной диагностики урогенитальных хламидиозов.
Основные принципы диагностики хламидийной инфекции — те же, что и при другой бактериальной патологии. Тестовые процедуры включают в себя:
1. прямую визуализацию агента в клинических образцах при окраске (бактериоскопический метод)
2. определение специфических хламидийных антигенов в клинических образцах
3. непосредственную изоляцию из тканей больного (бактериологический метод)
4. серологические тесты, при которых определяются антитела (демонстрация изменяющихся титров)
5. определение специфических хламидийных генов в клинических образцах.
2.1. Бактериоскопический метод
Принцип метода Бактериоскопические исследования предполагают выявление морфологических структур хламидий в пораженных клетках (клиническом материале).
Материально-техническое обеспечение метода.
Материалом для исследования служат соскобы с доступных исследованию слизистых оболочек мочеполовых органов (уретра, шейка матки, влагалище), а также конъюнктивы, прямой кишки и др., при экстрагенитальных формах.
Методика.
Соскобы со слизистых оболочек мочеиспускательного канала и шейки матки берут ложкой Фолькмана, специальной щеточкой или зондом, соблюдая правила антисептики. Выделения и слизистую пробку цервикального канала удаляют тампоном. Соскобы из глубины уретры и цервикального канала осуществляют со всех четырех квадрантов. В материале должны присутствовать эпителиальные клетки. Присутствие выделений и примесей крови маскируют хламидий и затрудняют диагностику. При экстрагенитальных поражениях соскобный материал получают аналогичным способом.
Взятый материал распределяют тонким слоем на поверхности обезжиренного предметного стекла, подсушивают и фиксируют. Мазки окрашивают по Романовскому — Гимза. При окраске по Романовскому-Гимза необходимо обнаружение в соскобном материале цитоплазматических включений хламидий (тельца Гальбедштедтера-Провачека). Включения содержат крупные ретикулярные тельца, которые окрашиваются по Романовскому-Гимза в синий цвет, и мелкие элементарные тельца, окрашивающиеся в фиолетово-красный. Включения по цвету и внутренней структуре отличаются от ядра клетки и цитоплазмы. Они располагаются в виде «шапочки» около ядра. На ранних стадиях развития включения могут быть 2−5мкм диаметром, зрелые включения увеличиваются в размерах и могут занимать всю цитоплазму, оттесняя ядро на периферию клетки-хозяина. Для постановки диагноза хламидийной инфекции достаточно обнаружить одно типичное цитоплазматическое включение.
Показания и противопоказания метода.
При диагностике урогенитального хламидиоза метод исследования мазков, окрашенных по Романовскому-Гимза, характеризуется сравнительно низкой чувствительностью (10−20%) и редко применяется в настоящее время. Рекомендуется использование при конъюнктивите ново
рожденных и острых глазных инфекциях взрослых, когда чувствительность этого метода составляет 90−100%.
2.2.Выявление антигенов в клинических образцах.
2.2.1. Метод люминесцирующих антител.
Принцип метода.
Бактериоскопические исследования предполагают выявление антигенов хламидий в пораженных клетках (клиническом материале).
В рутинной лабораторной практике можно использовать как прямой (ПИФ), так и непрямой иммунофлуоресцентный методы (НИФ). Первый метод предполагает обработку препарата непосредственно специфическими моно- или поликлональными антителами, меченными флюоресцеином, при использовании второго препарат обрабатывается сначала иммунной сывороткой, содержащей немеченые антихламидийые антитела, а затем антивидовой флуоресцирующей сывороткой.
Материально-техническое обеспечение метода.
Люминесцентный микроскоп
Холодильник бытовой
Термостат
Пипетки дозаторные
Предметные стекла
Карандаш по стеклу
Моноклональные или поликлональные антитела к хламидиям
Масло иммерсионное не флюоресцирующее
Контрольные препараты, содержащие и не содержащие хламидий (положительный и отрицательный контроль).
Инкубационная камера для препаратов
Ацетон
Спирт
Эфир
В настоящее время выпускается ряд отечественных и импортных коммерческих тест-систем с использованием меченных флюоресцеином моноклональных антихламидийных антител, такие как «ХлаМоноСкрин» и “ХлаМоноСкрин-2” (ЗАО “Ниармедик Плюс”), MicroTrak (Syva,), Ch.trachomatis IFA (Medac GmbH, Германия), а также тест-система с использованием меченых флюоресцеином поликлональных антихламидийных антител — Хламислайд (ЛАБдиагностика).
Методика.
Методика обработки препаратов излагается в инструкциях, прилагающихся к тест-системам. Высушенные на воздухе препараты фиксируют охлажденным (4°С) ацетоном в течение 10 мин., покрывают раствором флюоресцирующих антител (25−50 мкл), инкубируют во влажной камере при температуре, указанной в инструкции, промывают 2 раза по 5 мин. фосфатно-солевым буфером (NaCI — 6,8г; КН2РО4 — 0,63г; Na2HPO4 — 1,48г на 1л дистиллированной воды, рН 7,2). После высушивания препарат исследуют в люминесцентном микроскопе. Для длительного хранения или при невозможности просмотра ex tempore препарат монтируют покровным стеклом на каплю забуференного глицерина (9 частей глицерина + 1 часть 0,01М Na2HPO4, рН 8,5). Хранить препарат до просмотра можно в холодильнике при 4°С сроком до 1 недели.
Просмотр осуществляют в люминесцентном микроскопе с возбуждающими фильтрами ФС1−2, БС8−2 и запирающим фильтром СЗС24−4. При использовании не флюоресцирующего иммерсионного масла увеличении объектива 90х, окуляра 7х. Можно также пользоваться водноиммерсионным объективом 60х и окуляром 5х.
Коммерческие препараты моно- или поликлональных антител обычно содержат синьку Эванса или родамин, которые элиминируют неспецифическое свечение и окрашивают цитоплазму клеток в красный или оранжевый цвет. При просмотре мазков эпителиальных клеток антигены хламидий выявляются на красном или оранжевом фоне цитоплазмы эпителиальных клеток или на темном фоне препарата в виде единичных ярко-зеленых ЭТ и РТ. Значительно реже встречаются внутриклеточные включения в виде околоядерных “шапочек” зеленого цвета. Согласно инструкции фирм-изготовителей, для постановки положительного диагноза необходимо обнаружение не менее 10 ЭТ или РТ либо одного типичного внутриклеточного включения.
Показания и противопоказания метода.
Метод люминесцирующих антител для определения антигенов хламидий в материале больного применяется в популяциях с высокой степенью риска. Контроль излеченности методом люминесцирующих антител следует проводить не ранее, чем через 3−4 недели после окончания приема антибиотиков, так как возможно получение ложноположительных результатов при недостаточно быстрой элиминации антигенных детерминант хламидий, содержащихся в составе фрагментов разрушенных клеток. Особые трудности вызывает истолкование результатов анализа в случае обнаружения единичных хламидийных клеток. Мы считаем, что в случае первичного выявления единичных хламидийных ЭТ или РТ при отсутствии клинических симптомов желательно повторить исследование либо получить подтверждение результатов с помощью метода молекулярно-биологической диагностики (наиболее распространенным является метод полимеразной цепной реакции ПЦР). При выявлении единичных хламидийных клеток после лечения следует провести посев материала на культуре ткани, либо, при недоступности лаборатории культуральной диагностики, проводить анализ методом ПИФ, НИФ или ПЦР с интервалом 1−2 месяца.
Метод ПИФ и НИФ менее чувствителен, чем выделение в культуре ткани, но обладает высокой специфичностью. Применение коммерческих диагностических наборов, содержащих люминесцирующие моноклональные антитела к родоспецифическим (ЛПС) и видоспецифическим (ОБНМ) антигенам хламидий в соскобных препаратах урогенитального тракта значительно увеличивает чувствительность бактериоскопического метода. Она составляет 70−75% для цервикальной инфекции, несколько ниже — 60−70% для уретральной инфекции у мужчин. Специфичность около 98%. К положительным качествам метода люминесцирующих антител относится быстрота исполнения, высокая специфичность. Положительные результаты ПИФ и НИФ не требуют подтверждающих тестов. Недостатком является некоторый субъективизм оценки, необходимость квалифицированного микроскописта, осуществляющего просмотр, невозможность автоматизации.
2.2.2. Метод иммуноферментного анализа.
Метод ИФА для выявления антигенов хламидий не имеет широкого применения в практике, т.к. дает большое количество ложноположительных результатов и нуждается в применении подтверждающих или дополнительных тестов. Однако этот метод может применяться для исследования ректальных и назофарингеальных образцов, микроскопирование которых затруднено.
2.3. Бактериологический метод
Принцип метода.
Хламидий не размножаются на искусственных питательных средах. Их паразитизм обусловлен выраженной метаболической зависимостью от клетки хозяина. Бактериологический метод диагностики основан на выделении хламидий из исследуемого материала путем заражения первичных или перевиваемых клеточных культур. В процессе культивирования производят идентификацию возбудителя и определение чувствительности к антибиотикам. Инфицирование желточных мешков куриных эмбрионов и белых мышей в настоящее время не применяется в рутинной диагностике и используется для ведения лабораторных штаммов.
Материально-техническое обеспечение метода.
Стандартное оборудование для лаборатории культуры клеток или ткани (бокс или ламинарный шкаф, термостат, СО2,- инкубатор, холодильник).
Морозильная камера (-70°С)
Центрифуга
Пипеточные дозаторы
Лабораторная посуда для культуры ткани
Пробирки плоскодонные
Стекла покровные
Среда 199 или среда Игла
Эмбриональная сыворотка крупного рогатого скота
Сыворотка крупного рогатого скота
Антибиотики и антимикотики
Ступки фарфоровые
Оборудование для проведения ПИФ и НИФ (см.2,2.1)
Методика
Исследуемый материал тот же, что и при бактериоскопическом методе. Материал помещают в 1 мл охлажденной стерильной транспортной среды со стеклянными бусами (добавленными для измельчения материала) и пересылают в лабораторию. В качестве транспортной среды используют среду 199 или среду Игла с добавлением 5% эмбриональной сыворотки крупного рогатого скота. В состав транспортной среды вводят гентамицин (40 ед./мл) или другие антибиотики, не влияющие на жизнеспособность хламидий, для подавления сопутствующей флоры, и антимикотические препараты (нистатин 25 мкг/мл).
При невозможности немедленной доставки в лабораторию материал можно хранить при +4 °С в течение суток, при -20 °С не более 2 недель, при -70 °С — в течение длительного периода времени. После трехчасовой инкубации (при 4°С) с антибиотиками исследуемый материал размельчается путем встряхивания с бусами или ультразвуком.
Выделение хламидий в культурах клеток.
Для выделения хламидий клетки линии L-929, МсСоу или Hela выращивают на покровных стеклах, помещенных в плоскодонные пробирки. Посевная доза клеток- 100 тыс. кл/мл среды. В питательную среду Игла или 199 добавляется 5% сыворотки крупного рогатого скота. Через 24 час культивирования клетки должны давать рост в виде монослоя. До инокуляции инфекционного материала клеточный монослой обрабатывается ДЕАЕ -декстраном (30 мкг/мл.) в течение 30 мин. После инокуляции исследуемого материала на монослой культуральных клеток (по 0,2мл в 2 плоскодонные пробирки со стеклами, покрытыми клеточным монослоем) применяют метод принудительной адсорбции — центрифугирование при 3000 об/мин в течение часа. После центрифугирования неадсорбированный материал удаляют, клетки промывают культуральной средой без сыворотки. Затем клетки помещают в питательную среду с добавлением 5% эмбриональной сыворотки крупного рогатого скота, 5% 0.5 М раствора глюкозы и с антибиотиком циклогексимидом (0.5 -1.0 мкг/мл), подавляющим синтетическую активность клетки-хозяина, дальнейшее культивирование проводят в течение 48−72 часов при температуре 35,5°С .
Оценку результатов производят через 48−72 час методами ПИФ или НИФ (с использованием специфических поли- и моноклональных антител), а также при окраске по Май — Грюнвальд — Гимза или раствором Люголя. Окрашивается 1 стекло.
При получении отрицательных результатов рекомендуется произвести новый посев (пассаж) материала. Из оставшейся пробирки через 72 час после инфицирования сливают среду, стекла растирают в стерильной ступке, добавляют слитую среду и 1 мл свежей ростовой культуральной среды, содержащий 2% эмбриональной сыворотки, 1% глюкозы и антибиотик (обычно — гентамицин) в поддерживающей концентрации. Инфицирование клеточного монослоя и оценку результатов осуществляют по стандартной методике.
При исследовании препаратов инфицированных клеточных культур хламидий выявляются в виде характерных цитоплазматических включений, окрашенных в соответствующий методу цвет. Выявление хотя бы одного цитоплазматического включения, имеющего специфическое окрашивание, форму и структуру достаточно для констатации факта хламидийной инфекции в исследуемом объекте.
Определение чувствительности хламидий к антибиотикам.
Хламидий чувствительны к антибиотикам тетрациклинового ряда, макролидам, фторхинолонам. Пенициллин и его производные вызывают образование L-подобных форм микроорганизмов, способных реверсировать в инфекционные формы после прекращения действия антибиотика.
При постановке теста антибиотикочувствительности хламидий материал от больного помещается в 3 пробирки, содержащие монослой чувствительных клеток. Через 36 после обычной процедуры инфицирования 1 стекло делится на 2 части. Одна часть окрашивается раствором Люголя, вторая — люминесцирующими моноклональными антителами к хламидиям (ПИФ или НИФ).
Из оставшихся 2 пробирок через 72 час после инфицирования сливают среду, стекла растирают в стерильной ступке, добавляют слитую среду, 1мл свежей ростовой культуральной среды с 2% эмбриональной сыворотки, 1% глюкозы и антибиотиком. Инфицирование клеточного монослоя осуществляют по стандартной методике (1 пассаж).
Аналогичную процедуру проводят через 72 час после инфицирования (2 пассаж).
В случае обнаружения хламидии во втором пассаже зараженных клеток культуральную жидкость сливают, стекла, на которых находятся клетки с хламидиями, растирают в стерильных ступках, материал объединяют с культуральной жидкостью и разливают по 0,3мл в 24 пробирки, содержащие покровные стекла с клеточным монослоем. После обычной процедуры инфицирования добавляется среда с антибиотиками. Для каждого антибиотика берется минимальная ингибирующая концентрация (МИК) и двойная МИК. Минимальная ингибирующая концентрация определяется предварительно в опытах с перевиваемыми штаммами C.trachomatis. Титрование антибиотиков проводится на культуре клеток, зараженных Ch.trachomatis с множественностью заражения не менее 20%. Эритромицин добавляется в концентрации 50мкг/мл (МИК) и 100 мкг/мл, ципрофлоксацин — 25мкг/мл (МИК) и 50 мкг/мл, ломефлоксацин — 20 мкг/мл (МИК) и 40 мкг/мл.
С каждой концентрацией испытуемого антибиотика берут 2 пробирки положительного контроля (перевиваемый штамм Ch.trachomatis с множественностью заражения не менее 20%) и 2 — отрицательного контроля с незараженным монослоем чувствительных клеток.
Через 72 час после добавления антибиотиков стекла с клеточным монослоем фиксируют и проводят ПИФ (НИФ) на хламидии, и/или окраску на наличие гликогена. Отсутствие включений при обеих концентрациях антибиотика трактуется, как наличие чувствительности к данному препарату. Отсутствие включений при двойной МИК при наличии их при МИК учитывается как слабая чувствительность к данному антибиотику.
Показания и противопоказания метода
Метод диагностического выделения хламидии в культуре клеток может быть использован в течение всего периода заболевания, за исключением периода антибиотикотерапии и в течение месяца после него. Однако в настоящее время метод культуральной диагностики в основном применяется при контроле излеченности для выявления жизнеспособных хламидии, способных осуществлять полный цикл развития. По специфичности (100%) метод диагностического выделения хламидии в культуре клеток является эталонным. Чувствительность не достигает 100%, согласно разным источникам, она колеблется от 75% до 95%, однако более чувствительным является только метод амплификации ДНК.
Так как некоторые биологические жидкости организма (например, семенная или синовиальная жидкости) содержат ингибиторы роста клеточных культур, выделение хламидии в этих случаях требует особых методических приемов.
2.4. Серологические методы диагностики.
Принцип метода
Методы серологической диагностики хламидиоза основаны на определении специфических антител в сыворотке крови, а также в секретах лиц, больных или имеющих хламидиоз в анамнезе. Интерпретацию результатов серологического обследования следует проводить в совокупности с анализом клинико-эпидемиологических данных, а также с учетом особенностей использованного серологического теста.
Для серодиагностики в настоящее время наиболее часто используют иммуноферментный анализ (ИФА на наличие антител). Общий принцип ИФА-дигностики следующий: антиген фиксируется на твердой поверхности, обрабатывается испытуемой сывороткой, а затем антивидовым иммуноглобулином, связанным с ферментом, визуализирующимся после добавления субстрата. Достоинством метода является возможность автоматического учета результатов и выявления классов антител — IgG, IgA, IgM. Учитывая низкую иммуногенность «урогенитальных штаммов» хламидии и возможность присутствия антител после ранее перенесенной хламидийной инфекции, необходимо исследовать несколько проб сыворотки в динамике заболевания с интервалом в 2- 3 недели.
Общеупотребительным методом серодиагностики является реакция непрямой иммунофлюоресценции для выявления антител (НИФ). При проведении НИФ используются фиксированные очищенные антигены хламидии, нанесенные в виде точек на стекло. Нанесенная сыворотка больных реагирует с антигенами различных серотипов, после чего обрабатывается антивидовой люминесцирующей сывороткой. Тест чувствителен, во многих случаях дает информацию о серотипе хламидии, и целесообразен при эпидемиологических исследованиях.
В руководствах прежних лет описывается реакция связывания комплемента (РСК) для серодиагностики хламидиозов, однако в настоящее время в силу относительно слабой чувствительности РСК применяется только при диагностике системного хламидиоза — венерической лимфогранулемы,
Материально-техническое обеспечение метода
Стандартное оборудование лаборатории для проведения иммуноферментного анализа (спектрофотометр, термостат, холодильник, пипеточные дозаторы).
Тест-системы для ИФА на определение антител к Ch.trachomatis. Эти тест-системы более чувствительны по сравнению с тест-системами для определения хламидийных антигенов. В них может быть использован липополисахарид для выявления родоспецифических антител (тест-система с рекомбинантным ЛПС — pChlamydian ELISA (MEDAC GmbH, Германия). В последнее время получили распространение пептидные тест-системы с видоспецифическими белковыми антигенами (ОБНМ) клеточной стенки хламидий (Immunocomb, Orgenic,Израиль).
Методика
Инструкции по применению тест-систем заложены в диагностические наборы.
Показания и противопоказания к применению метода
Серологические тесты по определению IgG в сыворотке крови информативны при генерализованных формах инфекции, а также в тех случаях, когда инфицированные органы не доступны для непосредственного исследования (при инфицировании СП. pneumoniae, при инфицировании органов малого таза, пневмониях новорожденных).
При локализованной урогенитальной инфекции информативным является изучение показателей местного иммунитета (в цервикальном секрете у женщин, в соке простаты и семенной плазме у мужчин). В последние годы появляются данные о том, что для мужской популяции с хламидийными простатитами лучшим, маркером является измерение титров антихламидийных IgA в семенной плазме. При обследовании бесплодных пар этот показатель более информативен, чем исследование сыворотки крови. Следует иметь в виду, что IgA появляются в цервикальном секрете женщин и семенной плазме мужчин через некоторое время после начала инфекционного процесса и, следовательно, эти тесты не подходят для диагностики острого хламидийного инфекционного процесса. Показатели местного иммунитета (IgA в секретах) по значимости обычно совпадают с показателями гуморального иммунитета (IgG в сыворотке крови) у женщин, и статистически достоверно не совпадают — у мужчин, по-видимому, вследствие наличия гемато-тестикулярного барьера.
Серологические тесты не следует использовать в качестве исследования на контроль излеченности, т.к. титр антител остается достаточно высоким в течение нескольких месяцев после лечения, однако они хорошо применимы при дифференциальной диагностике хламидиоза. Особенно высока ценность этого метода при хронических бессимптомных формах хламидийной инфекции органов малого таза (простатиты, эпидидимиты, сальпингиты, сальпингоофориты). Чувствительность и специфичность тест-систем для определения антител к хламидиям не менее 95%.
2.5. Методы амплификации нуклеиновых кислот
Принцип метода
Методы ДНК диагностики основаны на комплементарном взаимодействии нуклеиновых кислот, которое позволяет с высокой точностью идентифицировать последовательность нуклеотидов в генах искомого микроорганизма. Из многочисленных модификаций данного метода следует выделить полимеразную цепную реакцию (ПЦР), как получившую наибольшее распространение. Метод ПЦР основан на том, что в исследуемый образец, предположительно содержащий тот или иной инфекционный агент, вносятся синтезированные в лаборатории нуклеотидные последовательности (праймеры), комплементарные генетическому материалу искомого возбудителя. Такие праймеры способны специфически взаимодействовать с ДНК или РНК инфекционного агента. Если исследуемую пробу подвергнуть температурной обработке, то двуспиральная ДНК, содержащаяся в инфекционном агенте, денатурирует и становится доступной для взаимодействия с двумя праймерами, комплементарными определенной зоне ДНК или РНК исследуемого объекта. При повторных циклах денатурации и ренатурации нуклеиновых кислот образца в определенных условиях (содержание в реакционной смеси дезоксинуклеотидтрифосфатов и термофильной ДНК полимеразы) достигается избирательное размножение (амплификация) участка нуклеиновой кислоты определенного размера, который задается при выборе праймеров. Этот метод широко используется для прямой детекции различного генетического материала вирусной и бактериальной природы.
Лигазная цепная реакция — это второй метод амплификации ДНК. В основе метода лежит лигирование (сшивание) олигонуклеотидов, комплементарных определенным участкам ДНК мишени. В методе используется способность ДНК — лигазы соединять две пары комплементарных олигонуклеотидов после их гибридизации с геномной ДНК мишени in vitro. По своим характеристикам этот метод сравним с ПЦР.
Материально-техническое обеспечение метода
Оборудование стандартной лаборатории для проведения ПЦР. Тест система для проведения ПЦР (набор праймеров). Одна из основных причин возникновения артефактов при использовании ПЦР-диагностики кроется в том, что фирмы, производящие наборы реагентов или лаборатории, использующие их в повседневной работе, ориентируются на различные критерии оценки чувствительности и специфичности диагностических наборов. Возникающие разночтения не позволяют сравнивать результаты, полученные в разных лабораториях, компрометируют сам метод и, в конечном счете, отражаются на достоверности клинического диагноза. Поэтому требования к качеству тест-систем должны быть очень строги, следует подчеркнуть недопустимость использования не сертифицированных тест-систем. В нашей практике используются праймеры Полимик (Литех).
Методика
ПЦР состоит из 3 основных процедур: подготовки исследуемой пробы материала, которая в большинстве случаев сводится к изоляции нуклеиновой кислоты, собственно ПЦР и детекции продукта ПЦР (амплифицированной ДНК или РНК).
Методика постановки реакции изложена в соответствующих методических рекомендациях.
Подготовка пробы материала должна производиться в условиях, исключающих ложноположительные результаты из-за перекрестного загрязнения исследуемых проб. Для исключения ложноотрицательных результатов необходимо выделение ДНК либо РНК, что позволяет осуществлять концентрированно исследуемой матрицы нуклеиновой кислоты в малом объеме. При необходимости следует провести удаление ингибиторов Taq-ДНК-полимеразы, что в ряде случаев отмечено при исследовании цервикальных образцов.
Следует отметить необходимость использования стандартных положительных и отрицательных контролей при каждой постановке.
Показания и противопоказания к применению метода
При диагностике хламидиоза методами амплификации нуклеиновых кислот подходит материал любого тканевого генеза. Большим преимуществом методов амплификации нуклеиновых кислот является возможность диагностики «неинвазивным» способом — исследование первой порции утренней мочи, что может применяться для скрининга больших групп населения. Следует отметить, что исследование утренней мочи более чувствительно при обследовании мужчин, для женщин предпочтение отдается исследованию цервикальных образцов.
Определение нуклеиновых кислот хламидий не должно применяться при контроле излеченности, так как фрагменты нуклеиновых кислот нежизнеспособных бактерий могут определяться в течение нескольких месяцев после проведенного лечения. Как упоминалось выше, при контроле излеченности следует применять метод культуральной диагностики.
Достоинством ПЦР является возможность определения широкого спектра возбудителей в одном клиническом образце. Для этого полученный препарат распределяется на равные порции, число которых равно числу определяемых инфекционных агентов. В каждую из порций вносится реакционная смесь и специфический набор праймеров для каждой из искомых инфекций. Таким образом, можно получить «микробиологический паспорт», т.е. полные сведения о наличии всех возбудителей в исследуемой клинической пробе.
Следует подчеркнуть, что ДНК-матрицы генов в условиях инактивации ДНК-азы пригодны для ПЦР в течение длительного времени (десятки, сотни и даже тысячи лет).
Чувствительность ПЦР и ЛЦР может достигать математически возможного предела (детекция 1 копии ДНК-матрицы).
В то же время следует иметь в виду, что само по себе использование метода молекулярно-биологической диагностики не является гарантией от получения ошибочных результатов. Высокая чувствительность метода обуславливает необходимость строгого соблюдения специальных требований к режиму работы ПЦР-генодиагностической лаборатории.
3. Меры предосторожности при диагностике урогенитальных хламидиозов
Сбор и обработку клинического материала для выявления или выделения Chlamydia trachomatis проводят, соблюдая режим работы бактериологических лабораторий. Необходимо исключать возможность загрязнения исследуемым материалом рук лабораторных работников, его попадания в глаза, нос, рот.
Хламидий быстро инактивируются под действием высокой температуры: при 60°С — в течение 15 минут. При 80°С — через 10 минут, при кипячении — через 3 минуты. Материал, содержащий штаммы Ch. psittaci, может быть обеззаражен в течение 3 часов при комнатной температуре: фенолом (1%р−р), хлорамином (3% р-р), лизолом (3% р-р), марганцовокислым калием (1:500), формалином с содержанием 38−40% формальдегида.
Урогенитальные штаммы хламидий Ch. trachomatis высокочувствительны к 70° этанолу, растворам 2% лизола, 0.05% нитрата серебра, 0,1% иодида калия, 0.5% перманганата калия, 25% перекиси водорода и инактивируются при комнатной температуре в течение 2 суток. Хлорамин в 3% концентрации инактивирует микроорганизмы в течение 1 минуты.
Заключение
Разнообразие методик, применяющихся в последние годы для диагностики урогенитального хламидиоза, приводит к определенным трудностям при их применении в системе практического здравоохранения. Большой опыт работы по диагностике этого заболевания в ЦНИКВИ и анализ литературных данных позволяет нам сделать некоторые обобщения и разработать алгоритм обследования больных в зависимости от стадии заболевания, анамнеза (давность заболевания, наличие предшествующего применения антибиотиков), особенностей используемой тест-системы.
Бактериоскопический метод исследования следует применять при заболеваниях глаз, где чувствительность этого метода 90−100%. При симптоматических формах урогенитального хламидиоза адекватные результаты диагностики могут быть получены при определении антигена хламидий методом ПИФ или НИФ (чувствительность 60−75%, специфичность около 98%), при использовании бактериологического метода культивирования in vitro на чувствительных клетках (чувствительность метода, по разным источникам, от 75% до 95%, специфичность 100%), молекулярно-биологическим методами, из которых самым распространенным является ПЦР (чувствительность 100%, специфичность приближается к 100% при соблюдении режима работы специализированной лаборатории и при использовании сертифицированных тест-систем). Контроль излеченности оптимально проводить бактериологическими методами. При неудачах лечения рекомендуется проводить тест на антибиотикочувствительность. В тех случаях, когда инфицированные органы недоступны для прямого микроскопического исследования (воспалительные заболевания органов малого таза, бесплодие) информативным является использование серологических методов обследования (чувствительность и специфичность не менее 95%). Следует отметить, что тест-системы для определения антихламидийных IgM на ранних сроках инфицирования в настоящее время не зарегестрированы, а определение показателей местного (IgA) и гуморального (IgG) иммунитета будет давать отрицательные результаты при свежих формах хламидиоза. При диагностике бессимптомных и осложненных форм хламидиоза, на наш взгляд, оптимальным является применение серологических методов в сочетании с бактериологическими и молекулярно-биологическими методами обследования. Рекомендации по применению описаных методов суммированы в таблице:
Методы
Рекомендации
Время обследования
Комментарии
Бактриоскопический
Трахома конъюнктивит с включениями
1 ч
не чувствителен при урогенитальных инфекциях
Определение антигенов: ПИФ, НИФ
ИФА
Образцы урогенитальные конъюнктивные
Ректальные назофарингеальные конъюнктивные
0,5ч 2−5 ч
образцы хранятся до 7 дней
образцы хранятся до 2−х недель
Бактериологический (культура ткани)
все хламидииные заболевания, кроме периодов антибиотикотерапии
48−72 ч
«золотой стандарт», применяется при контроле излеченности
Серологический
Инвазивные хламидииные заболевания
1,5−3 ч
при бесплодии, артритах, хронических заболеваниях органов малого таза, пневмониях новорожденных
Молекулярно-биологические методы (ПЦР, ЛЦР)
Любые образцы, в том числе сыворотка крови и секреты
возможно длительное сохранение материала

Поделиться:




Комментарии
Смотри также
13 июля 2002  |  00:07
УРОГЕНИТАЛЬНЫЙ ХЛАМИДИОЗ. КЛИНИКА, ДИАГНОСТИКА, ЛЕЧЕНИЕ
Урогенитальный хламидиоз - наиболее распространённая инфекция передаваемая половым путём (ИППП), встречающаяся в 2 - 4 раза чаще, чем гонорея и в 7,5 раз чаще, чем сифилис. По далеко не полным данным в мире ежегодно регистрируется до 89 млн. больных урогенитальным хламидиозом.
13 июля 2002  |  00:07
ИНФЕКЦИИ И РЕПРОДУКТИВНОЕ ЗДОРОВЬЕ (Часть I)
Инфекционно-воспалительные заболевания женских половых органов занимают особое место в структуре общей заболеваемости на планете. Их значимость обусловлена прежде всего тем, что эти болезни затрагивают органы и ткани, относящиеся к репродуктивной системе, а следовательно имеют непосредственное влияние на репродуктивную функцию и продолжение рода на земле. В первой части клинической лекции рассмотрены и подробно изложены современные аспекты проблемы репродуктивного здоровья.
13 июля 2002  |  00:07
ИНФЕКЦИИ И РЕПРОДУКТИВНОЕ ЗДОРОВЬЕ (Часть II). БИОХИМИЧЕСКИЕ И БИОЛОГИЧЕСКИЕ СВОЙСТВА ВЛАГАЛИЩНОЙ ЖИДКОСТИ
Во второй части рассмотрены новейшие представления о влагалищной жидкости как биологической среде организма. Собственные данные о биохимическом составе влагалищной жидкости получены совместно с канд.мед.наук Молчановым О.Л.
13 июля 2002  |  00:07
ИНФЕКЦИИ И РЕПРОДУКТИВНОЕ ЗДОРОВЬЕ. (Часть III). КЛИНИЧЕСКИЕ ПРОЯВЛЕНИЯ ИНФЕКЦИОННЫХ ЗАБОЛЕВАНИЙ ВЛАГАЛИЩА, ВКЛЮЧАЯ СТЗ
(БВ) - это заболевание, характеризующееся появлением обильных выделений из влагалища, в которых не обнаруживаются известные патогенные возбудители -Trichomonas vaginalis, Neisseria gonorrhoeae и грибы рода Candida.
13 июля 2002  |  00:07
ИНФЕКЦИИ И РЕПРОДУКТИВНОЕ ЗДОРОВЬЕ (ЧАСТЬ 4-Я). ЛЕЧЕНИЕ ИППП.
Гонорея. Жалобы пациенток зависят от локализации инфекционного очага. При поражении уретры (наиболее частая локализация) обычными симптомами являются болезненные ощущения при мочеиспускании: рези, жжение, зуд; дизурические явления: учащенное мочеиспускание, мочеиспускание малыми порциями мочи, появление чувства незаконченного мочеиспускания. Больные могут самостоятельно отмечать появление гонойного отделяемого из уретры. Однако, в течение короткого времени жалобы могут исчезнуть.